Bevezetés
Az antifreeze proteinek (AFP, fagyásálló fehérjék) a sarkköri éghajlaton élő állatok túlélését segítik azáltal, hogy gátolják a jégkristályok növekedését a testfolyadékban. E növekedésgátlás pontos folyamata, mechanizmusa még nem ismert, mert hihetetlenül fejlett számítógépes technika szükséges a jégkristályokon található antifreeze proteinek kötőhelyeinek megállapításához.
Az antifreeze proteinek típusai
[tablazat.jpg]
Alaninban gazdag alfa-hélixet tartalmazó antifreeze proteineket - I.típus - különböző halfajok termelik 3 eltérő rendszerből, hogy védelmet nyújtson számukra jeges tengervízben is egyaránt. A különböző típusok (I., II., III.) és az antifreeze glycoproteinek (AFGP) változatosságának eredete azzal magyarázható, hogy a halak különböző családjaiban hogyan jelent meg a tengerszint jegesedéséhez való alkalmazkodás. A különböző típusú AFP jelenléte a távoli rokonságban álló halaknál a laterális géntranszportnak tulajdonítható. Ez a strukturálisan komplex globuláris II.típusú lectin szerű antifreeze proteinek és az antifreeze glicoproteinek párhuzamos evolúcióban esetében valósul meg.IV-es típusú AFP-k fontos szerepet játszanak a zebrahal embriók fejlődésében
AFP-IV-ek trópusi halakban is jelen vannak, ami felveti a kérdést, hogy vajon lehet-e ezeknek a fehérjéknek a fagyásgátláson kívül más funkciójuk is. Zebrahalban mind az AFP-IV-a és AFP-IV-b specifikusan a YLS (Yolk Syncytial Layer)-ben választódtak ki. Érdekes módon az AFP-IV-a szintetizálása folytatódik az YLS-ben és az emésztőrendszerben a korai embrió kortól egészen a kifejlett példányokig, míg AFP-IV-b termelés csak az embrionális fejlődés folyamán történik. Az AFP-IV-nek fontos szerepe van az összehajló mozgásfolyamatokban, ezért mindkét afp4 protein szükséges a zebrahal embriók emésztőrendszerének fejlődéséhez.
Termodinamikai szempontból a rovar AFP-ket három csoportba lehet sorolni, diszulfidhíd tartalmuk és jégkötő felületük alapján: magas olvadáspontú AFP-k (magas diszulfid-tartalom, TxT mintázat), alacsony olvadáspontú, de magas visszahajtogatódó képességű AFP-k (egy diszulfid-híd, TxTxTxT mintázat) és irreverzibilisen kihajtogatott AFP-k alacsony hőmérsékleten (nincs diszulfid-híd, TxTxTxTxT motívum).
Az antifreeze proteinek dinamikus szerkezetének hatása
- Algák, rovarok, halak elbővülő képessége, hogy a fagyásgátló fehérjék (antifreeze proteinek=AFP) és az antifreeze glikoproteinek segítségével átvészeljék, túléljék a fagyás mechanizmusát. Ezek felületaktív molekulák, amelyek a víz-jég közötti határfelületen hatnak és akadályozzák meg a teljes dermedést. Különböző szervezetek szintetizálják őket, hogy sejtjeik ne sérüljenek, még az északi régiókban mért nagyon alacsony hőmérsékleten sem. A Ginzburg-Landau típusú megközelítés során a fázis elkülönítés eredményeként két-komponensű rendszert (jég-AFP) állapították meg. A szabad-energia sűrűség két területet foglal magában: az egyik a jégfázis alacsony AFP koncentrációval, a másik a folyékony víz fázis magas AFP koncentrációval van összefüggésben. Az idő alakulásával a jég felfedi a fázis elválasztásból eredő mikrostruktúrális változásokat az AFP-k jelenlétében. A fagyásgátló fehérjék hatására a szemcsék záródása, csoportosulása révén gyorsabban létrejön a jeges szerkezet, mely lényegében dinamikai folyamat. Ha a következőkben vízhozzáadás után a vízmolekulák adszorpciója gátlódik, a jégkristályok további növekedése is megáll. Az AFP-k által létrejött alacsony víz-jég közötti határfelületi energia lehetővé teszi a kisebb kritikus jég-magok kialakulását.
Az antifreeze fehérje maradványok körüli felületi víz dinamika
- Az antifreeze proteinek fagyásgátló aktivitását egy rövid-idejű hatás határozza meg, mely magában foglalja a jégfázishoz történő közvetlen kötődést. További kísérletek során felfedeztek egy hosszú-idejű hatást is, melynek során a víz dinamikájának erőteljes gátlása figyelhető meg, illetve ezáltal lehetővé válnak a jég-kötő folyamatok. Ezekért a hatásokért legfőképpen a fagyásgátló glikoproteinek (AFGP) felelősek. A különböző fagyálló protein maradványok körüli víz molekulák dinamikáját az atomi molekuláris dinamikai szimulációk segítségével vizsgálhatják. Az AFP prototípusát az antarktiszi nototheniadiből a fő alegységgel az alanin-alanin-threoninnal (AAT) egy mutánssal (polyalanin) együtt, a fagyálló glikoproteinek maradványaival mutatták ki. E prototípus körül a víz dinamikája erősen gátlódik a hidrogénkötés jellemzői és a dipoláris relaxációs idő következtében. Számos eredmény utal rá, hogy kiemelkedő jelentőségűek a poláris egységek, mint a threonin és a diszacharidok, melyek közvetlenül kötődnek a vízmolekulákkal a H-kötés révénés így jelentős gátló hatást fejt ki a víz dinamikájára. A hidratációs dinamika jelentős változása figyelhető meg az ozmotikumok jelenlétében, mint a karbamidban és a hydroxyectoine-ben. Az eredmények azt mutatják, hogy ez a hatás még kifejezettebb kozmotróp ozmotikumok jelenlétében.
Genomevolúció a hidegben – az antarktiszi jéghal
A Chionodraco hamatus egy, a jéghalak családjába (Channichthyidae) tartozó csontos hal faj, amely a Déli-sarkvidéken él. Ezen család tagjai az állandóan hideg és oxigén dús antarktiszi vizekben alakultak ki, megszerezve ezzel egyedi adaptációkat, morfológiai, élettani, és biokémiai szinten. A jéghalaknak, hasonlóan más Déli-sarkvidéki sugaras úszósokhoz, nincs úszóhólyagjuk és olyan antifreeze glikoproteineket (AFGPs) termelnek, amelyek kulcs innovációs lépést jelentenek a vér és testfolyadékok fagyásának kivédésében, amikor a környező hőmérséklet -1,86 Celsius fokra csökken. Ezen felül nem jelentkezik náluk a hősokk válasz sem. A jéghalak (Channychtyidae) vérében ezen felül kevés az oxigénkötő fehérje, és más szélsőséges tulajdonságaik is vannak, például az aerob szöveteikben igen sok a mitokondrium. Ezen halakról jelenttették meg, hogy a génállomány bővülése az evolúció velejárója, mégis a genetikai információ csekélysége határozza meg a sugaras úszójú halak hidegadaptációjának megértését. Rekonstruáltuk és feljegyeztük a Chionodraco hamatus (jéghal) első vázizom transzkriptumát, ellátva egy új forrással a jéghallal foglalkozó genomikát. Kihasználtuk a mély szekvenciáit ennek az energiaigényes szövetnek, hogy vizsgáljuk a feltételezést a gének szelektív duplikátum készítéséről, magában foglalva a mitkondriális funkciókat is. Kifejlesztettünk egy bioinformatikai megközelítést, hogy egyértelműen meghatározzuk a C. hamatus transzkriptumát, amivel egy törzsfejlődési ág öt modell fajából kiválasztottuk a közös őstől származó csoportot. A Chionodraco hamatus duplikátumait megtalálták minden közös őstől származó csoportban, lehetővé téve ezzel a jéghal leszármazására specifikus génduplikációk azonosítását. Szignifikánsan több duplikátumot találtak a jéghalban, amikor a transzkriptum adatokat a modell faj teljes genomjának adataival hasonlították össze. Sőt, a megkettőződött gének szignifikánsan gazdagabbak voltak mitokondrium lokalizációval rendelkező fehérjékben, beleértve a mitokondriális funkciókat és a biogenezist. Hideg állapotok között és oxigént szállító fehérje nélkül, az energiatermelés kihívást jelent. Az összetétele a magas mitokondriális sűrűségnek és a másolt gének fenntartásának – beleértve a mitokondriális biogenezist és az aerob légzést -, adhat egy szelektív előnyt azáltal, hogy fokozza az oxigén diffúziót és az energia tartalékokat az aerob szövetekben.
Ozmózisnyomásra adaptív válaszok a szivárványos lazac szemében
A szivárványos lazac (Osmerus mordax) egy csontos hal faj, amely úgy védekezik a fagyás ellen, hogy látszólag izoozmotikussá válik a tengervízzel. Ez a faj - hasonlóan más hideghez adaptálódott tengeri fajokhoz -, ciszteinben gazdag II.-es típusú antifreeze proteineket termel, bár csak kevés mennyiségben. Abban viszont eltér a többi fajtól, hogy glicerin, karbamid és trimetilamin-oxid termelődik a vérplazmájában és egyéb szöveteiben, ezzel az ozmotikus nyomás 325-ről 1000 mosmolra nő. A hatások, amelyek ilyen masszív változásokat hoznak létre az osmolaritásban, megtalálhatók a látás rendszerében és a nagyon fejlett és specializált keringési rendszerben, nem ismertek. Az új ismeret a szivárványos lazac szemének osmotikus adaptációjában szorosan összefügg e faj adaptációjával és túlélésével, és azon képességével, hogy a környezeti nyomás ellenére vizuális ragadozóként táplálkozik. Továbbá a szivárványos lazac molekuláris fiziológiai válasza az ozmotikus nyomásra, értékes betekintést nyújthat az emlősök kóros hyperozmotikus állapotainak – mint például a diabétesz -, megértésébe és kezelésébe. Ezen tanulmány által magunkra vállaltuk a feladatot, hogy egy eredeti értékelést adunk a szivárványos lazac ozmotikus adaptációja alatt zajló gén kifejeződésről a szem keringésében. Azoknál a lazacoknál - amiket kevesebb, mint 0,5 Celsius fok alatt tartottak -, szignifikánsan nőtt az üvegtestet kitöltő folyadék glicerin szintje és ozmotikus nyomása, azokéhoz képest, mint amiket 8-10 Celsius fokban tartottak. A 8-10 Celsius fokhoz alkalmazkodott mintapéldányokhoz képest a kevesebb, mint 0,5 fokon adaptálódottak csodarece erei és az érhártya ereinek endotheliális béléséhez kapcsolódó régiók magasabb szintű kifejeződését mutatják egy Tubedown (Tbdn) nevű proteinnek, ami a transzcelluláris endotheliális átjárók jelzőanyaga. Az emlősök Tbdn-jének és zonula occludens protein 1-ének (ZO-1) lazaccal ortológ fehérjéit is western blotting-gal mutatták ki, olyan emlős ellenes ellenanyagokat használva, amik ugyanazon epitópok ellen hatnak, mint amiket immunhisztokámiára használnak.Ez a tanulmány szolgáltat elsőként bizonyítékot arról, hogy a lazacok szemében fagyásgátló és hideg adaptációs folyamatok során olyan molekulák termelődnek és szabályoznak különböző módon, amikről tudjuk, hogy szerepet játszanak a szem vaszkuláris homeosztázisának kialakításában. Elővezetünk egy feltételezést, miszerint a hideg indukált hyperosmolaritás állapotában a ZO-1 kifejeződésében történő változások kapcsolatban vannak a kisméretű oldott anyagok a plazma térből, a szemet kitöltő folyadékba való áthaladásával, mialatt a Tbdn kifejeződésében történő változások szabályozzák a fehérjék vándorlását a plazma tér és a szemet kitöltő folyadék között. Az emlősökben előforduló cukorbetegség okozta hyperglikémia helyi, intraoculáris és mikrokörnyezeti ozmotikus stresszt okoz, ami a glikozilezés olyan megnövekedett mennyiségű végtermékeihez vezet, amelyek kapcsolatba hozhatók mikrovaszkuláris sérülésekkel a retinán. Annak természete, hogy a retina kóros elváltozásának hogyan áll ellen az ozmotikus stresszhez adaptálódott lazac szeme, olyan értékes és új nézőpontokat nyújhat, amelyek hasznosak lehetnek a diabetikus vasculopátia patobiológiájának megértéséhez az emlősökben. Ez a kutatás kibővítheti az alapvető tudásunkat olyan mechanizmusokról, amelyek alapjául szolgálnak a vér-retina gát metabolikusan lényeges összetevőkhöz, mint például a glicerinhez való alkalmazkodásának.
Ősi klímaváltozás, antifreeze és a déli-sarkköri halak diverzitásának evolúciós változása
A Déli-óceán a Déli-sarkkör a Föld leggyorsabban melegedő régiói között van, de az elmúlt 40 millió évben epizódszerű klímaváltozások történtek ezen a területen. Egyelőre tisztázatlan, hogy a klímaváltozás ősi ciklusai hogyan alakították az antarktiszi biodiverzitást. Az antarktiszi sugaras úszójú halakban lévő antifreeze glikoproteinek (AFGPs) eredete egy klasszikus példa lett arra, hogy egy kulcs innováció evolúciója válaszolva a klímaváltozásra hogy vezet adaptívszétterjedéséhez.A sugaras úszójúak időhöz kalibrált molekuláris fejlődéstörténetének és rekonstruált ősklíma használatával demonstráltuk, hogy az AFGP eredete 42 és 22 évmillió közötti időszakban bukkant fel, amely magába foglalja a globális lehűlés időszakát körülbelül 35 évmilliónál. Azonban a leg fajgazdagabb leszármazások váltak változatossá és szignifikáns ökológiai különbségek alakultak ki legalább 10 millió évvel az AFGP-k keletkezése után a második lehűlés alatt a késői miocénban. Ez a példa mutatja, hogy az AFGP nem az egyetlen kiváltó oka volt a sugaras úszójúak adaptív széterjedésének. Ehelyett kiváltó oka volt a késő miocén alatt és a korai pliocénban létrejött nagymértékű fajgazdagságnak és az ökológiai változatosságnak, ami időben egybeesett a sarkköri állapotok kialakulásával és a megnövekedett jég aktivitással a Déli-óceánban. Az eredményeink megkérdőjelezik a jelenlegi értelmezését az antarktiszi sugaras úszójú halak evolúciójának felvetve, hogy az ökológiai lehetőség - ami az alapjául szolgál ennek az adaptív szétterjedésnek-, nincs összeköttetésben egy egyedüli jelleggel, hanem inkább az AFGP-k által biztosított fagyás kivédés, és a megnövekedett glaciális és jégmező aktivitás által létrejött új élőhelyek és nyitott rések kihasználásának kombinációjával.
Farkashalak alkalmazkodása
A legtöbb hal hipoozmotikus a tengervízhez viszonyítva, így fagyáspontjukban különböznek. Ez jelentős veszélyt jelent a sekélyebb vizekben élő fajokra. AFP és AFP glikoproteinek függetlenül, több fajban is kialakultak, melyek csökkentik a testfolyadékok fagyáspontját.
A környezethez való adaptáció egyik módszere egyes gének megduplázódása /sokszorozódása (GDA).
Az Új-Fundland partjainál élő két farkashal-féle (a part menti vizekben lakó Atlanti farkashal /Anarhichas lupus/, és a mélyebb vizekben megbúvó Pöttyös farkashal /Anarhichas minor/) jó példa a fagyos vizekhez történő sikeres alkalmazkodásra. A farkashal-félék a Zoarcoidei alrendbe tartozó többi fajjal együtt olyan AFP-III-at állítanak elő, ami a sialic sav szintáz enzim kis C-terminális domainjéből származik. A sekélyebb vizekben élő Atlanti farkashal nagyobb veszéllyel néz szembe sekély élőhelye miatt. Hogy ellenálljon a fagyásnak, ez a faj ötször nagyobb AFP aktivitással rendelkezik a plazmájába, mint mélyebb vízi rokona. Ennek a különbségnek az alapja a bennük fellelhető AFP gének mennyisége. Az Atlanti farkashal körülbelül háromszor annyi AFP génmásolattal rendelkezik, mint a Pöttyös farkashal. Mivel a TH (thermal hysteresis) és az AFP koncentráció között inkább hiperbolikus, mint lineáris összefüggés áll fenn, a két faj között még nagyobb az AFP koncentráció különbsége, mint ahogy a TH értékéből gondolnánk. Az AFP transzkripció mértéke a májban (ami halaknál a plazmaproteinek fő szintetizálója) szinté többszörösen nagyobb az Atlanti farkashalban. Egy magyarázat a génmennyiségbeli és transzkripciós eltérésekre az Atlanti farkashal genomjában fellelhető ismétlések, melyek az AFP-t kódoló génállománya 2/3 részét teszi ki, és gyorsabb transzkripciót biztosítanak. Ilyen ismétlések nincsenek a Pöttyös farkashalban. A rendelkezésünkre álló bizonyítékok azt mutatják, hogy e két faj egy közös ősből fejlődött ki a fagyásveszélyes zóna felbukkanásának időpontjában. Az AFP géneknek duplázódása/erősödése a farkashal ős egyik szubpopulációjában elősegítette ennek a veszélyes élőhelynek a kiaknázását, a modernkori Atlanti- és Pöttyös farkashal fajok elkülönülését és evolúcióját.
A Cser-tövisescincér
Ellenben más rovar AFP-kkel, amiket ebből a szempontból vizsgáltak, a Cser-tövisescincérben (Rhagium mordax) található AFP1-nek csak 1 diszulfid-hídja van. Megállapították, hogy a protein olvadáspontja (Tm) 28,5C (pH 7,4) ami sokkal alacsonyabb, mint a legtöbb AFP-jé vagy globuláris proteineké általában. Leszámítva alacsony olvadáspontját, mind biofizikai mind aktivitásbeli mérések azt mutatják, hogy a fehérje majdnem teljesen visszahajtogatódik eredeti állapotába miután ismételten 70 °C–os hőhatásnak volt kitéve. A Rhagium mordax AFP-je kinetikailag stabil még magasan olvadáspontja felett is.