A TREK alcsaládba tartozó kálium csatornák szerepe

A káliumion csatornák minden sejttípus, sőt, egyes sejtorganellumok membránjában is megtalálhatók, nem csak az állat- de a növényvilágban egyaránt. Rengeteg élettani folyamatban kulcsfontosságú szerepet játszanak, az ingerületvezetéstől a tápanyagok felszívódásán át egészen a sejtek, illetve az egész szervezet ionháztartásának fenntartásáig.


A TREK alcsalád besorolása, szerkezete, lokalizációja és expressziója


felugró szöveg
1. Ábra
A kálium csatornák rendszere

A TREK/TRAAK csatornák funkcionális működésük szempontjából meghatározó szerkezeti felépítő elemük a szelektivitási filter. Ezen egység határozza meg a csatornán áthaladni képes részecskék anyagi minőségét. A szűrő kialakításában alapvető szerepet játszik a pórusdomén (a filter azon egysége, ami a csatorna pórusát, illetve legszűkebb kapuját alkotja).

Minden K+-csatorna szelektivitási filterét négy pórusdomén alkotja. A TREK alosztályba tartozó K+-csatornák a K2P (két pórusdoménnal rendelkező) csatornák családjába tartoznak. Mivel ezen család tagjainak alegységei két-két pórusdomént tartalmaznak, csatornáik két alegységből állnak (melyek alkothatnak homo- ill. heterodimert is), szemben a többi csatorna család négy alegységből, (alegységenként csak egy pórusdomént tartalmazó) felépülő csatornáival. Összesen tizenöt különböző alegységet ismerünk, ezeket funkcionalitás és szekvencia alapján a következő hat alosztályba soroljuk: TALK, TASK, THIK, TREK, TRESK, TWIK. (1. ábra) A két pórusdoménnal rendelkező K+-csatornák alegységei darabonként 4 transzmembrán szegmensből épülnek föl. Amíg az alegységek N-terminálisa rövid, intracellulárisan helyeződik, és nincs jelentős szabályozásbeli szerepe, addig a szintén intracellulárisan helyeződő C-terminális régión hat szinte minden (kivétel: kívülről befolyásoló hatások, mint a pH) szabályozó tényező. A két alegység extracellulárisan helyeződő hurokrégiója a "cap" (sapka) domént alkotja, melynek belsejében, a csatorna tengelyére merőlegesen fut az ún. extracelluláris ionút (EIP). Ennek közepéből nyílik a csatorna pórusa. Ezen összetett szerkezet határozza meg, milyen méretű és töltésű részecske fér hozzá a pórushoz. Továbbá ezen szerkezet okozza azt is, hogy a K2P családba tartozó csatornák számos K+-csatorna gátlószerrel szemben érzéketlenek. A Human Genom Organization (HUGO) által elfogadott szisztematikus nevezéktan: KCNK1-18 a csatorna alegységet kódoló génekre, ill. K2P1-18 az általuk kódolt csatornafehérjékre (nincsen 8-as, 11-es, 14-es sorszámú csatorna). Az ioncsatornák megnevezésében inkább a hagyományos nevek használatosak.

A TREK [TWIN-Related K+ channel] /TRAAK [TWIN-Related Aracidonic Acid stimulated K+ channel] alcsalád lokalizációja Tagjai a TREK-1 (K2P2.1; kódoló gén: KCNK2), TREK-2 (K2P10.1; kódoló gén: KCNK10) és a TRAAK(K2P4.1; kódoló gén: KCNK4) csatornafehérjék.

A TREK-1 és TREK-2 aminosav-szekvenciája jelentős mértékben megegyezik, ennek ellenére az expressziójukban nagy eltéréseket figyelhetünk meg, szövetspecifitásuk mértéke nem elhanyagolható. A TREK/TRAAK csatornák kifejeződését mind emberekben, mind rágcsálókban kutatták. A TREK-1/-2csatornák expressziója az egész embrionális egéragyban jelentős volt. Felnőtt egyedekben a TREK-1 kifejeződés inkább a hippocampus, a cortex, az amygdala és a hippothalamus, a TREK-2 esetén pedig a bulbus olfactorius, hippocampus, a kisagy szemcsesejtjei és a striatum területeire korlátozódott. A TRAAK csatornák egér esetében embrionális korban gyakorlatilag nem expresszálódtak, az ellést követő második hétre viszont elérte a maximumot a kifejeződés. A TREK-1-csatornák az idegrendszeren kívül sok más helyen megjelennek: szívizomzat, artériák simaizma, mellékvese, vese, erek endothel sejtjei, hámsejtek, tüdő. A TREK-2 csatornák nagymértékben a pancreasban, herében, lépben, kisebb mértékben a tüdőben, májban , méhlepényben, belekben expresszálódnak (Braun, 2015).

Szabályozás, mechano- és termoszenzitivitás


A TREK alcsaládba tartozó K+ csatornák alapvetően nem mutatnak nagy aktivitást. Természetes körülmények között stimulálja őket membrán feszülés, a sejtek duzzadása (mechanoszenzitivitás), továbbá a többszörösen telítetlen zsírsavak (polyunsaturated fatty acids-PUFA), lysophospholipidek, phosphatidinositol 4,5-biphosphate. Ezzel szemben gátolja őket a hypoozmózis csakúgy, mint a PKA (proteinkináz-A) és PKC (proteinkináz-C) általi foszforiláció, valamint részlegesen gátolható Ba2+-mal is. A TREK-1 ioncsatorna neurontranszmitterekkel is gátolható, amely IC cAMPnövekedést,illetve G-protein aktivált útat hoz létre. Viszont serkenthető a működése illékony anesztetikumokkal, és számos kutatás bizonyítja a jelentőségét gyógyszeres reakciókban.

A TREK és TRAAK csatornák fokozatosan aktiválódnak a hőmérséklet növelésével. 14°C –ról 42°C-ra melegítve 7-20-szorosára emelkedik az aktivitásuk. Ez szignifikánsan magasabb, mint a többi K2p csatorna esetében. A maximális aktivitást 30°C-42°C között érik el.

A TREK és TRAAK csatornák érzékenyek az extracelluláris pH változásaira. A extracelluláris savasodás erősen gátolja a TREK-1 K+ csatornát, szemben a TREK-2 csatornával, ami ugyan abban a pH-tartományban aktiválódik.

A klasszikus K+ csatorna-gátló szerekre a TREK és TRAAK csatornák nem érzékenyek, így nem gátolhatók például 4-aminopiridinnel, tetraetil-ammónniummal (kis koncentráció), és Cs+-mal. A TREK-1 csatornát helyi érzéstelenítő szerekkel is lehet gátolni, például lidokainnal és bupivakainnal (Noël és mtsai, 2011).

Működése és jelentősége


A két pórusú káliumcsatornák - köztük a TREK alcsalád csatornái is - rendkívül sok élettani jelenséget, funkciót befolyásolnak illetve azokra valamilyen szinten hatással vannak. (2. ábra)

felugró szöveg
2. Ábra
A K2p csatornák hatásai

Idegrendszerben


Neuroprotektivitás

A RILUZOL (RP 54274) egy hatásos neuroprotektív képviselő,görcsöt,rángatózást akadályozó,nyugtató, antiischaemiás hatású tulajdonsággokkal rendelkezik. Jelenleg amyotrophiás lateralis sclerosis kezelésésben alkalmazzák. A riluzol aktiválja a TREK-1 és TRAAK csatornákat.Utóbbi aktivációja fenntartott/folyamatos, míg az elöbbié tranziens és gátlás követi. A gátlás folyamata az intracelluláris cAMP koncenráció növekedésnek tulajdonítható valamint a riluzol hatásának, mely protein kináz-A függő TREK-1 gátlódást hoz létre. TREK-1 mutánsokban hiányoznak a Ser maradványok, ahol a kináz-A foszforiláció aktivációja fenntartott módon megy végbe a riluzol által. A TRAAK részlegesen aktiválható riluzollal, mert a TREK-1-gyel ellentétben hiányzik a cAMP általi negatív reguláció (Duprat és mtsai, 2000).

Kísérleti egerekbe oltva a TREK-1 szétdarabolt gént, bizonyítani tudjuk hogy a csatorna fontos szerepet játszik az epilepszia illetve az agyi-és gerincvelői ischiemia neuroprotektivitásában. A telítetlen zsírsavak neuroprotektív hatása kifejeződik a TREK1+/+ egereken, de nem jelenik meg a TREK1−/− egerekben bizonyítja a TREK-1 jelentőségétt ezen kutatásban. A TREK-1 kiemelkedően fontos új terápiák kifejlesztésében a neurológia és az anesztézia területein (Heurteaux és mtsai, 2004). -

Antidepresszáns TREK-inhibítorok

Az utóbbi időben a kutatók KO (knock out) egereket használnak annak bizonyítására, hogy a K2P (két pórusú kálium csatornák) család döntő szerepet játszik a depresszió kialakulásában. Úgy tartják, a TREK-1 és TASK-3 antagonistái egy újfajta antidepresszáns gyógymódhoz vezethetnek.

A közelmúltban fedezték fel a TREK-1 kálium csatorna első azonosított blokkolóját a spadint.

A spadin egy természetes peptid, mely az NTSR-3 (neuortensin receptor-3) érése során szabadul fel, és speciálisan gátolja a TREK-1 csatornákat, így antidepresszáns tulajdonságokat mutat. Gyorsan hat és nincs mellékhatása. Nem okoz keringési rendellenességeket: nem módosítja a szisztolés nyomást és nem növeli a szívfrekvenciát.

A sortilin, más néven-NTSR-3 receptor-egy nemrég felfedezett partnere a TREK-1 csatornának, és úgy tűnik, szabályozza a csatorna plazmamembrán szintjét. Sejt szinten a sortilin köti a neurotensint, ami a „nerve growth factor (NGF)” prekurzora (Az NGF serkenti az idegsejtek proliferációját, részt vesz azok megvédésében), és a lipoprotein lipázt. Élettani szinten részt vesz egy sor kardiovaszkuláris neurológiai folymat szabályozásában. A sortilin funkciója, vagy diszfunkciója felelős lehet a hypercholesterinaemiáért és a szívinfarktusért, csakúgy, mint a neurodegeneratív rendellenességekért. Továbbá részt vehet a diabétesz, az elhízás és a rák kialakulásában (Borsotto és mtsai, 2015).

Szerepük az anesztéziában

A TREK-1 és TREK2 csatornák az illékony anesztetikumok - isoflurán, kloroform, halotán - klinikai koncentrációjának hatására kinyílnak, nagyfokú aktivitást mutatva. (Hasonló hatást fejt ki a riluzol, ami egy neuroprotektív gyógyszer, amit amiotrófiás laterálszklerózis (ALS, vagy Lou Gehrig-betegség) esetén szoktak alkalmazni.)

KO (knock out) egereken végzett kísérlet során, halotánnal és kloroformmal szemben az egerek csökkent érzékenységet mutattak, holott in vitro körülmények között ezek a TREK-1 csatorna leghatékonyabb aktivátorai. Hasonló eredmény született sevofluránnal és desfluránnal való kezelés után, melyek a legszélesebb körben használt klinikai altatószerek, csakúgy, mint az izoflurán. Ezek az eredmények alátámasztották azt az elképzelést, miszerint a TREK-1 és TREK-2 csatornák egyértelműen részt vesznek az illékony anesztetikumok hatásmechanizmusában (Heurteaux és mtsai, 2004).

Fájdalomcsillapítás és fájdalomérzékelés

Ezen kutatás/cikk demonstrálja, hogy a TREK-1 jelentős szerepet játszik mint molekuláris érzékelő a fájdalomészlelésben. A TREK-1 erősen kifejezett a kis érzékelő idegsejtekben, a peptiderg és non-peptiderg idegsejtekben valamint TRPV1-el rendkívűli módon átszőtt, amely kapszaicin aktiválta nonszelektív ioncsatorna. A szétroncsolt TREK-1 génnel kezelt egerek érzényekebbé váltak a fájdalmas hő érzetekre. Ez a fenotípus kapcsolatban áll az elsődleges érző neuronnal, vagyis a polimodális C-idegrostok sokkal hőérzékenyebbnek bizonyultak egyes idegrost kutatásokban. A génmanipulált állatok lényegesen érzékenyebbek a kis intenzitású mechanikai stimulusokra és jelentős szerepet játszanak a megnövekedett thermo,-mechanikai hiperalgéziaban, gyulladásos folyamatokban. A TREK-1 jelentős ioncsatornaként tűnik fel a polimodális fájdalomérzékelésben és előnyös célkitűzés új fájdalomcsillapítók kifejlesztésében (Alloui és mtsai, 2006).

Egyéb szervekben


Üreges szervek adaptív relaxatioja

A gastrointestinalis traktus folyamatosan változó átmérőjéhez és térfogatához a szervnek (simaizmoknak) alkalmazkodnia kell. A simaizom elemek feszülése közvetlenül stimulálja a non-selecting, mechanoszenzitív kationcsatornákat, mint például a Ca2+-csatorna. Az ezáltal létrejövő depolarizáció kontrakciót idéz elő. A gyomor-bél traktus egyes, jól körülírható, funkcionálisan elkülönülő területei feszülésre azonban ellentétesen reagálnak. Az itt található mechanoszenzitív K+-csatornák kifelé mutató K+ áramlást hoznak létre, melynek következtében kialakuló hiperpolarizáció a simaizomelemek elernyedését okozza, így a szerv adaptálódik a megnövekedett luminaris tartalomhoz. Mint kiderült, ezek a mechanoszenzitív csatornafehérjék: TREK-1, a gastrointestinalis traktusban, húgyhólyagban és a méh simaizomzatában, a TREK-2, a gyomor antrumában fordulnak elő. A húgyhólyag szintén nagymértékű térfogati tágulásra képes. Patkány, illetve emberi húgyhólyagot vizsgáltak relaxánssal, illetve egyéb farmakológiai megoldásokkal, és itt is bizonyították a TREK-1 csatornák háttér K+ áram fenntartásában, illetve adaptív relaxatioban betöltött fontosságát.

Kísérletekkel megállapították, hogy ezen csatornák aktiválódása negatív nyomás, illetve a sejtek elongációja esetén megy végbe. Tehát a simaizom akkor kontrahál, ha csökken a luminaris tartalom. A csatornafehérjék aktiválása történhet továbbá nitrogén-monoxiddal (NO), ami vagy idegvégződésekből, vagy endothel sejtekből szabadul fel, illetve szén-monoxid által. Mindkét vegyület a guanilát-ciklázt aktiválja, vagyis a környező simaizomsejtekben megemelkedett cGMP szint aktiválja a TREK-1 fehérjéket, és az így kialakuló hiperpolarizáció a simaizomelemek relaxációját okozzák (Enyedi és Czirják, 2010).

Szív mechanoelektromos kapcsoltsága

A szívizomsejtek nyugalmi potenciálját elsődlegesen a sarcolemma magas K+-vezető képessége tartja fönn. Többféle K2P K+-csatorna található a cardiomyocitákban (TWIK-1, TWIK-2, TASK-1, TASK-2, TASK-3, TREK-1, TREK-2, TRAAK és KCNK6), melyek valószínűleg nem csak nyugalmi körülmények között, de akciós potenciál alatt is funkcionálnak. A TREK-1 expresszálódik mind a pitvari, mind pedig a kamrai szívizom sejtekben is, azonban az expresszálódás mértéke mind faj, mind kor, mind pedig lokalizáció szempontjából eltérő. Például felnőtt patkányban nagyobb mértékben fordul elő, mint embrionális korban. Továbbá a csatornafehérje eloszlása nem egyenletes a kamra falában, endocardio-epicardialisan (a szívizomzat belső részétől kifelé haladva) csökken a sűrűsége. További érdekesség, hogy a szívizomsejtek felszínén egyenes sávokban helyeződnek a csatornák. Ez minden bizonnyal nem véletlen, hiszen a TREK-1 csatornák mechanoszenzitív szabályozása a szívizom különböző pontjain eltérő erősségű ingerekre eltérő erősségű válasszal reagál (az adott feszülésnek megfelelően). Ez az elrendeződés biztosítja a szív mechanoelektromos kapcsoltságát (a mechanikai erők hatása az elektromos tevékenységre, és fordítva). A hosszirányú feszülés non-specifikus kationcsatornák, illetve Cl--csatornák megnyílását okozza, így depolarizáció jön létre. A mechanoszenzitív K+-csatornák árama ezt a depolarizációt puffereli. A szívizomsejtek megnyúlásának mértéke eltérő a szív, illetve a fal különböző pontjain. A nyomásingadozás kevésbé kifejezett a szívfal külső részében, mint az endocardiumhoz közelebb eső részen. Éppen ez okozza, hogy a csatornafehérjék más-más mennyiségben vannak jelen a szív (és a fal) különböző részein.

A cardiomyocyták háttér K+-áramát szinte teljes egészében a TREK csatornák adják. Ebből következően az arachidonsav, az intracelluláris acidózis, a mechanikai feszülés vagy negatív nyomás, illetve az illékony anesztetikumok aktiválják ezt az áramot, míg az extracelluláis acidózis, cAMP analóg vegyületek, illetve a béta-adrenerg agonista isoproterenol gátolják. Utóbbi arra utal, hogy a béta-adrenerg reakció során a TREK csatornafehérjéket a PKA (Proteinkináz A) foszforilálja, ezáltal valószínűleg részt vesznek a pozitív ionotróp hatás kialakulásában (vagyis a szívizom kontraktilitásának növelésében).

Felmerült az az elképzelés is, hogy a TREK-1 csatornáknak funkcionális jelentőségük van a myocardialis ischaemiában (iszkémiában). Az ischaemiás körülmények között felszabaduló purinerg agonisták többlépcsős reakcióban, közvetetten, arachidonsavon keresztül stimulálják a TREK-1 csatornák működését. Az ischaemia során bekövetkező intracelluláris acidózis szintén serkentheti a csatornákat. Mivel egyre több megfigyelés utal arra, hogy a PUFA-k (PolyUnsaturated Fatty Acids/többszörösen telítetlen zsírsavak) nem csak neuroprotektív hatásúak, de csökkentik a szívinfarktus mértékét és a szívarritmiákat, úgy tartják, a TREK-csatornák talán a PUFA-k cardioprotektív hatását közvetítik (Enyedi és Czirják, 2010).

Mellékvesekéreg hormontermelése

A mellékvesekéreg aldoszteron és kortizol hormontermelése a gátlódó K+-csatornák, majd a depolarizáció miatt aktiválódó feszültségfüggő Ca2+-csatornák útján szabályozódik. Szarvasmarha zona fasciculata sejtjeit vizsgálva azt találták, hogy a TREK-1 felelős szinte teljes egészében a sejtek háttér K+-áramáért, vagyis a nyugalmi membránpotenciál kialakításáért. További vizsgálatokkal azt is megállapították, hogy a K+-áram gátlása az ACTH által a zona fasciculataban, illetve az Angiotensin II. által a zona glomerulosaban egyaránt a TREK-1 csatornákon keresztül érvényesül. Ennek megfelelően a TREK-1 K+-csatornáknak alapvető szerepük van a kortizol és aldoszteron szekrécióban.

Azonban állatfaji különbségek mutatkoznak a szarvasmarhával szemben, például patkányokban a zona glomerulosa sejtek háttér K+-áramáért leginkább a TASK-3, emberi glomerulosa-szerű sejtvonalat vizsgálva pedig a TREK-1 és TASK-3 csatornák együttes jelenlétét és működését mutatták ki (Czirják és Enyedi, 2010).

Prosztatarák proliferatiojában betöltött szerepe

Míg a normál prostata- és jóindulatú adenomasejtekben nincs kimutatható TREK-1 immunaktivitás, addig az invazív prostata carcinoma sejtek nagyon nagy mennyiségben expresszálják ezeket a csatornafehérjéket. A túlzott expresszió mértéke egyenes arányban áll a betegség fokával. A túlzott expresszió kifelé egyenirányító K+-áramot hoz létre, mely gátolható sipatrigin TREK-1 inhibitorral, illetve domináns TREK-1 negatív domén transfectiojával (DNS/DNS-szakasz átvitelével). További kísérletek azt is megmutatták, hogy a TREK-1 overexpressziója a normál epithelialis prostata sejtekben is fokozza a proliferatiot.

Ezek figyelembe vételével a TREK-1 csatornafehérjék terápiás célpontok lehetnek a prosztatarák kezelésében. Ezt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy a kurkumin vegyület, mely a prostata daganatsejtek apoptosisát indukálja, szintén gátolja a TREK-1 csatornákat, talán ezzel is elősegítve az apoptosist (Enyedi és Czirják, 2010).

Napjainkban a kálium csatornákat összefügésbe hozták a sejtosztódás folyamatával, és néhány, a K2P család tagjai közül, mint például TASK-3 túlkifejezett módon volt megjeleníthető speciális daganatokban. Normális állapotú prosztata, valamint jóindulatiú hyperplasia esetén nem találkozunk TREK-1 csatornákkal a prosztata szöveteiben, ezzel ellentétben a rákos szövetekben nagy számban fordulnak elő ilyen csatornák. Ezt bizonyítják a prosztata szöveteiből, illetve sejtvonalakból végzett kísérletek. Ezenfelül a TREK csatornák megjeleneséből következtethetünk a betegség előrehaladottságára utalva ezzel a csatornák megjelenése és az abnormális sejtburjánzás kapcsolatára. In vitro körülmények között bizonyítható a TREK-1 kifejeződése PC3 és LNCaP prosztatarák sejt vonalakban, de nem detektálták normál prosztata epithelsejteiben (NPE). A csatornák megjelenésének /számának csökkentése a PC3 sejtekben setosztódás mértékének csökkentését okozta. Ezen adatokat összegezve megállapítható, hogy a TREK-1 csatornák molekuláris vizsgálata újszerű módszer/ jelzőrendszer a prosztatarák vizsgálatában és kezelésében (Voloshyna és mtsai, 2008).

Összegzés

A TREK alcsalád csatornái számos ismert és talán még több, még nem ismert élettani folyamatban játszanak döntő szerepet. Sok új betegség, élettani jelenség magyarázataként szolgálhatnak az új eredmények, segítve ezzel az orvosok munkáját és a betegek gyógyulását. Kutatásuk napjainkban igen intenzíven zajlik és az elért eredmények sikere vitathatatlan.

Irodalomjegyzék


Alloui, A.; Zimmermann, K.; Mamet, J.; Duprat, F.; Noël, J.; Chemin, J.; Guy, N.; Blondeau, N.; Voilley, N.; Rubat‐Coudert, C.; Borsotto, M.; Romey, G.; Heurteaux, C.; Reeh, P.; Eschalier, A.; Lazdunski, M.(2006): TREK‐1, a K+ channel involved in polymodal pain perception. The EMBO Journal 25: 2368-2376

Borsotto, M.; Veyssiere, J.; Moha ou Maati, H.; Devader, C.; Mazella, J.; Heurteaux, C. (2015): Targeting two-pore domain K+ channels TREK-1 and TASK-3 for the treatment of depression: a new therapeutic concept. Br J Pharmacol 172: (3) 771–784.

Braun, G. (2015): A hátsó gyöki ganglionban kifejeződő TREK-2 és TRESK két pórusdoménű K+ csatornák vizsgálata.Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola, Doktori értekezés

Duprat, F.; Lesage, F.; J. Patel, A.; Fink, M.; Romey, G.; Lazdunski, M. (2000): The Neuroprotective Agent Riluzole Activates the Two P Domain K+ Channels TREK-1 and TRAAK. Molecular Pharmacology 57: (5) 906-912;

Enyedi, P.; Czirják, G. (2010): Molecular Background of Leak K+ Currents: Two-Pore Domain Potassium Channels. Physiological Reviews Published 90: (2) 599-605

Heurteaux, C.; Guy, N.; Laigle, C.; Blondeau, N.; Duprat, F.; Mazzuca, M.; Lang-Lazdunski, L.; Widmann, C.; Zanzouri, M.; Romey, G.; Lazdunski, M. (2004): TREK-1, a K+ channel involved in neuroprotection and general anesthesia. EMBO J. 23: (13) 2684–2695.

Noël, J.; Sandoz, G.; Lesage, F. (2011): Molecular regulations governing TREK and TRAAK channel functions. Channels (Austin) 5: (5) 402–409.

Voloshyna, I.; Besana, A.; Castillo, M.; Matos, T.; Weinstein, B.; Mansukhani, M.; B. Robinson, R.; Cordon-Cardo, C.; J. Feinmark, S. (2008): TREK-1 Is a Novel Molecular Target in Prostate Cancer. Cancer Res. 68: (4) 1197-203.


Ábra jegyzék


1.ábra: https://en.wikipedia.org/wiki/Potassium_channel

2.ábra: saját


TREK_csatorna (last edited 2017-05-04 23:02:04 by R0BED8)